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Anti-herpes simplex virus actividades de diglicérido monogalactosil y digalactosildiglicérido de nutans Clinacanthus. una tradicional medicina herbaria tailandesa Sirada Pongmuangmul 1,2 Supaporn Phumiamorn 3 Phanchana Sanguansermsri 1 Nalin Wongkattiya 4 Ian Hamilton Fraser 5 Donruedee Sanguansermsri 1,6 ,. 1 Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan, Phitsanulok 65000, Tailandia 2 Regionales Ciencias Médicas Centro Nakhonswan, Departamento de Ciencias Médicas, Ministerio de Salud, Nakhonswan 60130, Tailandia 3 Instituto de Productos Biológicos, Departamento de Ciencias Médicas, Ministerio de Salud, Nonthaburi 11000 , Tailandia 4 Facultad de Ciencias, Universidad de Maejo, Chiang Mai 50290, Tailandia School 5 de Química de la Universidad de Monash, Victoria 3800, Australia Centro 6 de Excelencia en Biotecnología médica, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan, Phitsanulok 65000, Tailandia recibió 19 de noviembre de 2015. Revisado el 1 de diciembre de 2015. Aceptado 8 de diciembre de 2015. Disponible en línea el 6 de enero de 2016. Resumen Objetivo evaluar el diglicérido monogalactosil (MGDG) y digalactosildiglicérido (DGDG) de nutans Clinacanthus (C. nutans) por sus actividades antivirales in vitro contra el herpes virus simplex tipo 1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2) por el ensayo de reducción de placas. Métodos MGDG y DGDG se extrajeron con cloroformo a partir de C. nutans hojas. MGDG y DGDG fueron separados de cloroformo extracto crudo mediante cromatografía de columna, que se caracteriza por cromatografía en capa fina y se cuantifica por cromatografía líquida de alta resolución. La lucha contra el VHS-1 y 2 actividad frente a pre-tratamiento y post-tratamiento de los compuestos se evaluó utilizando el ensayo de reducción de placas. La citotoxicidad del extracto y los compuestos sobre células Vero se realizaron mediante el ensayo de MTT. Resultados MGDG y DGDG obtenidos por cromatografía en columna mostraron perfiles idénticos como norma estándar MGDG y DGDG utilizando cromatografía en capa fina y cromatografía líquida de alta resolución. MGDG y DGDG de C. nutans mostraron 100 inhibición de HSV-1 en la replicación en el paso posterior de la infección a una concentración no citotóxica con valores de IC50 de 36,00 y 40,00 g / ml, y HSV-2 a 41,00 y 43,20 g / ml, respectivamente. Por otra parte, MGDG y DGDG de C. nutans se demostrado que tiene actividad anti-herpes simplex en el mismo nivel como compuestos sintéticos estándar. En contraste, el tratamiento previo de las células Vero con MGDG y DGDG antes de HSV-1 y HSV-2 infección no mostró efecto inhibidor frente a estos virus. MGDG y DGDG exhiben actividad antiviral contra HSV-1 con el índice de selectividad de 26,00 y 23,00 y HSV-2 de 23,30 y 21,30. Conclusiones MGDG y DGDG de C. nutans. una medicina herbal tradicional tailandés ilustra la actividad inhibidora contra HSV-1 y HSV-2, probablemente por la inhibición de la etapa tardía de la multiplicación, lo que sugiere su uso prometedor como agentes anti-HSV. Palabras clave glicoglicerolípidos monogalactosil diglicérido digalactosildiglicérido Clinacanthus nutans del herpes simple tipo 1 del virus de virus herpes simplex tipo 2 Actividad antiviral 1 Introducción virus herpes simplex tipo 1 infecciones (HSV-1) y tipo 2 (VHS-2) se distribuyen en todo el mundo en los seres humanos con diferente grado de gravedad. Todo ello puede conducir a condiciones peligrosas para la vida, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. HSV-1 es más frecuentemente asociada con lesiones mucocutáneas orofaciales. HSV-2 se asocia más comúnmente con herpes genital. Los virus del herpes pueden causar primaria, e infecciones recurrentes sobre la reactivación viral a través de estímulos como la luz solar, el estrés y la inmunidad debilitada 1 y 2. El fármaco de elección de la profilaxis y tratamiento de la infección por HSV es aciclovir, un análogo de nucleósido, que inhibe selectivamente la replicación de HSV con toxicidad celular bajo anfitrión 3 y 4. medicamentos antivirales Sin embargo, la aparición de virus resistentes a los usados ​​comúnmente es un problema en el tratamiento, especialmente en pacientes inmunocomprometidos y lactantes 5. 6 y 7. en consecuencia, existe una necesidad de búsqueda de nuevo y agentes antivirales más eficaces que pueden sustituir o complementar a que actualmente se utilizan medicamentos antivirales 8. Las plantas medicinales son conocidos por ser una fuente de abundante de compuestos químicos y tradicionalmente utilizado en la asistencia sanitaria en muchos países. Un gran número de plantas, ya sea en forma de extractos o compuestos puros, se ha demostrado que presentan actividad antiviral 9. 10 y 11. Clinacanthus nutans (Burm. F.) Lindau (C. nutans) es una planta medicinal en la familia Acanthaceae que es nativa de muchos países tropicales de Asia, incluyendo Tailandia y, a menudo cultivadas. C. nutans se ha utilizado tradicionalmente como un medicamento para el tratamiento tópico de erupciones en la piel, de insectos y de mordedura de serpiente, HSV y varicela-zoster virus lesiones 12 y 13. Los ensayos clínicos han informado de la utilización con éxito de C. nutans tratamiento tópico para el alivio de inflamación de la piel y picaduras de insectos, herpes genital y lesiones de varicela-zoster 14. extracto crudo de C. nutans hojas ha demostrado inhibir HSV-1 y HSV-2 actividad 15. En la investigación fitoquímico, flavonoides, esteroides, triterpenoides, cerebrósidos, dos glicoglicerolípidos , glicéridos, glicéridos que contienen azufre fueron aislados de esta planta 16 y 17. Trigalactosyl y digalactosil diglicéridos aislados de C. nutans se ha demostrado que presentan actividad antiviral 18. glicoglicerolípidos sintéticos también se ha demostrado que inhibe HSV 19. En este estudio, la inhibición de HSV-1 y HSV-2 por dos glicoglicerolípidos: monogalactosil diglicérido (MGDG) y digalactosil diglicérido (DGDG), aislado de C. nutans y extracto de cloroformo crudo de C. nutans hojas se investigaron usando el ensayo de reducción de placas . Además, el modo de las actividades inhibidoras también se determinó mediante la adición del compuesto en los diferentes pasos de la replicación del virus. 2 Materiales y métodos 2.1 materiales de plantas y extracción C. nutans plantas fueron recolectadas de Uthai Thani, Tailandia por Warayu Leeprasert, tailandés experto en plantas medicinales. Las hojas secas se extrajeron con cloroformo utilizando un aparato de extracción Soxhlet a 60ºC durante 8 h. extractos enteros se recogieron y el disolvente se evaporó a sequedad con un evaporador rotatorio. Los extractos crudos se almacenaron a 20 C hasta que se usaron en las pruebas. 2.2 Preparación de MGDG y DGDG Los extractos crudos se purificaron parcialmente en una columna de gel de sílice 60 mediante elución exhaustiva con 350 ml de cada una de las siguientes etapas de elución: cloroformo: acetona (9: 1, 3: 1 y 1: 1), acetona pura y acetona: metanol (3: 1) se recogieron 20. y 50 ml de cada fracción y se evaporaron para la identificación adicional de MGDG y DGDG. Cada fracción se verificó para MGDG y DGDG por cromatografía en capa fina (TLC) y se compara con el estándar de MGDG y DGDG (Larodan AB, Suecia). La fase de identificación MGDG constaba de cloroformo: acetona: agua destilada (30: 60: 2). Fase móvil para la identificación DGDG constaba de cloroformo: acetona: metanol: ácido acético glacial: agua destilada (100: 40: 20: 30: 10) 21. Las fracciones que contenían MGDG o DGDG se combinaron y se evaporaron usando un evaporador rotatorio. Confirmación de MGDG se realizó mediante TLC con 2 sistemas de fase móvil, cloroformo: acetona: agua destilada (30: 60: 2) y acetona: ácido acético glacial: agua destilada (100: 2: 1) se realizó 22. Confirmación de DGDG usando TLC con 2 sistemas de fase móvil, cloroformo: metanol: ácido acético glacial: agua destilada (85,0: 15,0: 10,0: 3,5) 22 y cloroformo: acetona: metanol: ácido acético glacial: agua destilada (100: 40: 20: 30 : 10) 21. Se observó que la cantidad de MGDG y DGDG y se determina por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando un Agilent 1100 equipado con detector de matriz de fotodiodos a 254 nm. MGDG y DGDG se separaron a 30ºC usando una columna de sílice, el tamaño de 200,0 mm 4,6 mm, tamaño de partícula 5 m (sílice Hypersil). El caudal fue de 1 ml / min y la fase móvil era hexano: iso-propanol (97,5: 2,5) 23. 2.3 Virus y líneas celulares de células Vero (células de riñón de mono verde africano) se hicieron crecer en monocapa cultivadas con Dulbecco Modificado Medio Eagle, suplementado con suero bovino fetal 5. HSV-1 y HSV-2 fueron proporcionados por el Dr. Panadda Dhepakson, Biotecnología Médica Center, Departamento de Ciencias Médicas, Tailandia. Las reservas de virus se prepararon a partir de cultivos infectados en células Vero con medio de mantenimiento (Dulbecco modificado medio de Eagle, 2 de suero bovino fetal y 1 antibiótico), propagada a 37 C, 5 CO 2 y el virus de título se determinó por ensayo de placas en células Vero. 2.4 Ensayo de citotoxicidad La citotoxicidad se evaluó por el ensayo MTT. Un volumen de 100 L de células Vero a una concentración de 2,5 10 5 células / ml se sembraron en placa de 96 pocillos y se propaga a 37 C con 5 CO 2 durante 1 día. El medio de cultivo fue reemplazado por un medio de mantenimiento fresco que contiene diferentes concentraciones de extracto de cloroformo crudo, extraído y purificado o MGDG DGDG. Las células se incubaron a 37 C con 5 CO 2 durante 2 días, y se añadió el reactivo MTT (20 L) a cada pocillo. Después de 4 h de incubación adicional, el formazano se solubilizó mediante la adición de HCl diluido (0,04 mol / L) en isopropanol, y se determinó la absorbancia a 490 nm mediante un lector de placa Biotek ELISA con una longitud de onda de referencia de 620 nm. La concentración citotóxica 50 (CC 50) que provoca cambios morfológicos visibles en 50 de las células Vero se determinaron 24. 2.5 Ensayo de actividad antiviral La actividad antiviral de glycoglycerolipid de Phaya guiñada se evaluó mediante el ensayo de reducción de placas como se ha descrito anteriormente se añadieron 25. Los compuestos en diferentes etapas durante el ciclo de infección viral con el fin de rastrear el modo de acción antiviral. 2.6 Pre-tratamiento La monocapa de células Vero se trató previamente con extracto de cloroformo crudo, MGDG, DGDG, estándar MGDG, DGDG estándar y aciclovir a 37 C durante 24 h antes de la infección de virus. Después del lavado, las células se infectaron con HSV-1 o HSV-2 a una multiplicidad de infección de 0,1 a 37 C durante 1 h. Se lavaron las células infectadas, y sobrepuesto con 3 ml de 1,2 metilcelulosa nutriente y se incubaron a 37ºC durante 48 y 96 h para HSV-1 y HSV-2, respectivamente. Las células infectadas se fijaron con formaldehído 5, se tiñeron con violeta cristal al 0,5 y después se contó el número de placas. Se determinó el porcentaje de la concentración de la actividad inhibidora y el CI 50 se determina a partir de la curva que relaciona el porcentaje de concentración de actividad inhibidora a la concentración de las muestras. 2,7 Post-tratamiento de las células confluentes Vero se infectaron con 100 unidades formadoras de placa de HSV-1 o HSV-2. Después de la adsorción a 37ºC durante 1 h, las células infectadas se lavaron y se cubrieron con 3 ml de 1,2 metilcelulosa nutriente que contiene cloroformo extracto crudo, MGDG, DGDG, estándar MGDG, estándar DGDG y aciclovir en diversas concentraciones y se incubaron a 37ºC durante 48 y 96 h para HSV-1 y HSV-2, respectivamente. Las células se trataron a continuación como se describió anteriormente para el ensayo de reducción de número de placa viral. 3 Resultados 3.1 Aislamiento y caracterización de extracto crudo y MGDG y DGDG de C. nutans extracto crudo de C. nutans hojas secas se obtuvieron después de la extracción de cloroformo con un rendimiento de 7. A continuación, el extracto crudo se ejecuta a través de una columna de gel de sílice y se eluyó secuencialmente con 5 eluyentes diferentes. Las fracciones de 50 ml se recogieron según el método descrito por Diehl et al. 20. Después de ejecutar el extracto crudo, MGDG se eluyó a partir de fracciones 1215 y DGDG se eluyó a partir de fracciones 2628. Las porciones combinadas de cada fracción de MGDG y DGDG eran preliminares identificados por TLC (Figura 1) cuando se utilizan diferentes sistemas de fase móvil. El MGDG de C. nutans mostró R similares f como el MGDG estándar (Figura 1 a, b), así como los DGDG de C. nutans y el estándar de DGDG (Figura 1 c, d). La identificación de extractos de MGDG y DGDG se confirmaron por HPLC. perfiles de HPLC obtenidos a partir de extractos MGDG y DGDG se compararon bien a la de la norma MGDG y DGDG (Figura 2). Figura 1. TLC cromatograma de MGDG extraído y purificado de C. nutans y estándar MGDG en cloroformo: acetona: agua (a) y en acetona: ácido acético glacial: agua (b), se extrajo y purificó a partir de DGDG C. nutans y estándar DGDG en cloroformo: acetona: agua (c) y en acetona: ácido acético glacial: agua (d). Figura 2. cromatograma HPLC. R: extraído y purificado a partir de MGDG C. nutans B: Estándar MGDG C: extraído y purificado a partir de DGDG C. nutans D: Estándar DGDG. 3.2 Citotoxicidad Para examinar los posibles efectos citotóxicos de extracto de cloroformo, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans sobre la viabilidad celular, las células Vero se incubaron con diferentes concentraciones (10 015 000 g / ml) de los compuestos para 48 h y la viabilidad celular fue medido por el ensayo de MTT. Como se muestra en la Figura 3. extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans mostró un efecto inferior tóxico que el cloroformo extracto crudo. En la Tabla 1 se informó de la CC50 para estos compuestos. En este estudio, el extracto de cloroformo, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans fueron investigados para la eficacia contra HSV-1 y HSV-2 células Vero infectadas. En las células Vero, la CC 50 de extracto de cloroformo, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans fue de entre 520 y 960 g / mL. Actividad de la extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans era menos tóxico que el extracto crudo cloroformo. Figura 3. Determinación de CC 50 de extracto de cloroformo crudo, extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans en células Vero. Tabla 1. La citotoxicidad, anti-HSV actividad en el post-tratamiento, y el índice de selectividad de cloroformo extracto crudo, extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans. estándar MGDG, DGDG estándar y aciclovir. ND: No hay detección. 3,3 contra HSV-1 y 2 La actividad del efecto del extracto de cloroformo, MGDG y DGDG de C. nutans en HSV se evaluó para la inhibición en diferentes etapas de la infección. Las células Vero fueron pre-tratadas con extracto de cloroformo crudo, extraídos y purificados MGDG, extraídos y purificados DGDG, estándar MGDG y DGDG estándar en diferentes concentraciones a niveles subtoxic. Para el post-tratamiento, se añadieron los compuestos a las células después de la infección viral. El aciclovir también fue utilizado como un control de fármaco en el estudio de anti-HSV. A las concentraciones máximas no citotóxicas de todos los compuestos, los anti HSV-1 y HSV-2 actividades con post-tratamiento mostraron 100 inhibición de la formación de la placa mientras que pre-tratamiento mostró menos de 50 inhibición de la formación de placa (Figura 4). El resultado indicó que el extracto de cloroformo, se extrajo y MGDG y DGDG purificada de C. nutans. estándar MGDG y el estándar DGDG afectados predominantemente anti-HSV-1 actividades en la infección viral post con IC 50 valor de 115.00, 36.00, 40.00, 31.00 y 33.60 g / ml, actividades, respectivamente, y lucha contra el VHS-2 con CI 50 valor de 140.00, 41.00, 43,20, 33,40 y 36,80 g / ml, respectivamente. Además, el aciclovir expresó el valor IC 50 en post-tratamiento en 0.64 y 0.80 g / ml para HSV-1 y HSV-2 (Tabla 1). En particular, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans mostró actividad antiviral con índices de selectividad (CC 50 / IC 50) en HSV-1 de 26,0 y 23,1 y en HSV-2 de 23,3 y 21,3, respectivamente (Tabla 2). Figura 4. Modo de actividades inhibidoras de extracto de cloroformo crudo, extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans contra HSV-1 (A) y HSV-2 (B) durante las diferentes etapas de la infección viral. Los virus se trataron con la concentración subtóxica máxima de los compuestos. El aciclovir se utilizó como control en cada experimento. Datos representados el porcentaje de inhibición del virus, en comparación con los controles no tratados como media SD. Tabla 2. índice de selectividad de extracto crudo, extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans en la replicación de HSV-1 y HSV-2 en el post-tratamiento. índice de selectividad (CC 50 / IC50) Cloroformo extracto crudo MGDG de C. nutans DGDG de C. nutans 4 Discusión Para muchas generaciones, las plantas medicinales se han utilizado por los indígenas para el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, incluyendo la infección por HSV. La medicina moderna utiliza actualmente aciclovir y otros derivados de nucleósidos se han utilizado en el tratamiento de infecciones por HSV. Sin embargo, estos son caros y un gran número de personas, especialmente de los países en desarrollo, puede no ser capaz de pagar los medicamentos de alto costo. Por lo tanto, algunas plantas medicinales que se pueden encontrar de forma local sería un tratamiento alternativo. En este estudio, la actividad antiviral de cloroformo extracto crudo, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans fueron investigados por su actividad antiviral contra HSV-1 y HSV-2 en células Vero. Ensayo de citotoxicidad es una parte importante para la evaluación de un agente antiviral potencial debido a un extracto o compuestos deberían ser selectivos para los procesos específicos del virus con poco o ningún efecto sobre el metabolismo celular de acogida. Pre-tratamiento de las células Vero con el extracto de cloroformo, se extrajo y MGDG y DGDG purificada durante 24 h antes de la infección viral demostraron que estas muestras mostraron 50 efecto protector contra el proceso de infección por HSV-1 y HSV-2. Por el contrario, los resultados mostraron que extrae y purifica MGDG y DGDG de C. nutans demostró 100 inhibición de HSV-1 y HSV-2 replicación en la fase de post-infección a niveles de concentración subtoxic. Por otra parte, se extrajo y se purificó MGDG y DGDG de C. nutans exhibido actividad anti-HSV en el mismo nivel como el estándar de muestras de MGDG y DGDG. Los compuestos extraídos y purificados muestran moderada contra HSV-1 y HSV-2 actividad con valores de CI50 que van desde 36,00 hasta 43,20 g / mL. Además, el extracto de cloroformo crudo de C. nutans ha mostrado menos eficaz contra HSV-1 y HSV-2 que el extraído y purificado MGDG y DGDG. Se puede postular que MGDG y DGDG son uno de los principales contribuyentes hacia la inhibición de la replicación del virus herpes. El índice de selectividad muestra que extrae y purifica MGDG y DGDG de C. nutans son selectivos para la inhibición de HSV-1 y HSV-2 infección. Similar al aciclovir, extraídos y purificados MGDG y DGDG inhiben HSV-1 y HSV-2 replicación. El aciclovir inhibe específicamente la ADN polimerasa viral durante el ciclo de replicación viral cuando nuevo ADN se sintetiza 26. A partir de este estudio, se podría decir que las actividades inhibidoras contra HSV-1 y HSV-2 de extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans son los más eficaces en la etapa de post de la infección. A pesar de que el mecanismo de la actividad anti-HSV de MGDG y DGDG todavía no está claro, un informe mostró que algunos monoglicéridos mostraron actividad antiviral contra virus envueltos por la destrucción de las envolturas virales 27. Estudio de los diglicéridos sintéticos monoglycosyl también mostró actividad inhibidora contra HSV-1 y HSV-2 en células Vero 19. Esto está de acuerdo con el estudio anterior informó de que el efecto inhibidor de C. nutans extracto contra HSV-1 y HSV-2 antes de la infección la entrada viral a las células huésped 15. El componente activo de C. nutans. clorofila a y la clorofila b. También se encontró que tenían actividad anti-HSV antes de la entrada viral paso 16. Otros investigadores también han informado de anti-HSV actividades de extractos de hexano, diclorometano y metanol de C. nutans en la etapa de post infección de 15. Es interesante observar que este difiere de un estudio en el que los extractos de agua y disolvente orgánico de C. nutans no inhibió la replicación de HSV en células Vero 28 y 29. En conclusión, este estudio ha descubierto las actividades inhibidoras de extraído y purificado MGDG y DGDG de C. nutans contra el HSV-1 y HSV-2, probablemente, en la etapa de post entrada viral. C. nutans es una medicina herbaria tailandesa utilizado para la infección del herpes durante muchas generaciones y la hierba es generosamente disponibles en todo el sudeste de Asia. MGDG y DGDG de C. nutans han demostrado que tiene actividad anti-herpes simplex en el mismo nivel que los compuestos sintéticos disponibles en el mercado. Declaración de conflicto de intereses Declaramos que no tenemos ningún conflicto de intereses. 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