Cloranfenicol 121

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El cloranfenicol-Sensitive cepa de Escherichia coli que expresa la cloranfenicol acetiltransferasa (cat) Gen RESUMEN Una cepa de Escherichia coli (cepa CM2555) que lleva la cloranfenicol acetiltransferasa (cat) de genes se encontró que era sensible a cloranfenicol. Se demuestra que el gen cat se expresa de manera eficiente en CM2555 cepa. Nuestros resultados sugieren que la disminución de los niveles de acetil coenzima A en gato expresando células CM2555 en presencia de cloranfenicol puede causar la bacteria sea sensible a este antibiótico. Uno de los mecanismos de resistencia bacteriana a los antibióticos mejor caracterizadas es la síntesis de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (3. 9. 12. 23). La producción de esta enzima, codificada por el gen cat, es el medio más común por el cual las bacterias se hacen resistentes a cloranfenicol (13. 22), una pequeña antibiótico bacteriostático que interactúa con un centro de peptidil transferasa (16). CAT cataliza la transferencia del resto acetilo de la acetil coenzima A (acetil-CoA) a una molécula de cloranfenicol (8, 12). Por lo tanto modificado, cloranfenicol ya no se une a los ribosomas y el producto de síntesis de proteínas (12). Recientemente, una cepa de Escherichia coli, cepa CM2555, se identificó en el que no se seleccionaron los transformantes cuando se utilizó cloranfenicol como el agente selectivo durante los intentos de introducir los plásmidos que llevan el gen cat (21). cepa gato llevando los CM2555 se encontró que era sensible a cloranfenicol (21). El objetivo del trabajo que se describe aquí fue investigar el mecanismo de esta phenomemon. Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este trabajo se enumeran en la Tabla 1. Las cepas de E. coli y plásmidos utilizados en el estudio Para el Western Blot, después de dodecil sulfato de sodio (SDS) electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con 12,5 geles de poliacrilamida, o PÁGINA las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad) con un aparato de transferencia semiseco (Schleicher & Schuell). La proteína CAT se visualizó con un suero anti-CAT específica (Sigma Aldrich) con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina como se describió previamente (20). La cantidad relativa de CAT se estimó mediante densitometría. Preparación de extractos celulares crudos y medidas espectrofotométricas de la actividad bioquímica CAT se realizaron como se ha descrito previamente (11). Se determinó la concentración intracelular de acetil-CoA espectrofotométricamente como se describió anteriormente (10). La eficiencia de la síntesis de proteínas se estimó por medición del nivel de incorporación de precursores radiactivos en el material precipitable con ácido tricloroacético como se ha descrito previamente (18), pero se añadieron 14 aminoácidos C-marcado (UVVVR) para cultivos bacterianos a una concentración final de 2,5 Ci / ml. E. coli CM2555 tiene un defecto genético que conduce a su sensibilidad a cloranfenicol en presencia de gato. Strain CM2555 ha sido descrita como una de las series de mutantes ilv dnaA (CM2555 lleva el alelo dnaA508) de otro modo a la cepa isogénica CM732 (4). Sin embargo, utilizando un conjunto de cepas bacterianas y plásmidos (Tabla 1), se encontró que la sensibilidad de la cepa CM2555 cloranfenicol que lleva el gen cat no es causado por el alelo dnaA508 o la combinación de ilv y alelos dnaA508 (datos no mostrados). Por lo tanto, se concluye que la cepa CM2555 debe contener otro, previamente mutación (s) no identificada que hace que sea sensible al cloranfenicol, a pesar de la presencia del gen CAT. La expresión del gen cat en CM2555 cepa. Densitométrico análisis de electroferogramas después de SDS-PAGE y de transferencias Western con suero anti-CAT reveló que CM2555 / pBR328 produce al menos tres veces más CAT que la cepa parental, CM732 / pBR328 (datos no mostrados). Para probar si un mayor nivel de CAT desempeña un papel en los mecanismos de la sensibilidad a cloranfenicol de CM2555, se utilizó plásmido pJKP1 que lleva el gen cat bajo el control de un promotor inducible, p lac. junto con otro plásmido, pJMH1, que alberga el alelo lacI q. La adición de isopropyl-- d - tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM dio como resultado niveles de CAT (tanto en CM2555 y hosts CM732) que correspondía a alrededor de 90 de la que se encuentra en CM732 / pBR328 (datos no mostrados). Contrariamente a los resultados obtenidos en los experimentos de control, el aumento de la eficiencia de la expresión de CAT en correlación con el crecimiento más rápido de la cepa CM2555 / pJKP1 / pJMH1 en un medio que contiene cloranfenicol sólo hasta concentraciones de IPTG de 0,1 mM, y un aumento adicional de la eficiencia de la expresión de cAT resultó en la inhibición del crecimiento bacteriano (Fig. 1). Por lo tanto, se sugiere que la eficacia de la expresión del gen cat puede ser importante para la sensibilidad de cloranfenicol CM2555 cepa. Efecto de la cantidad intracelular de CAT sobre el crecimiento bacteriano en presencia de cloranfenicol. E. coli CM732 y CM2555 albergar pJKP1 y pJMH1 se cultivaron en medio líquido Luria-Bertani. la expresión del gen cat de la fusión - cat p lac se indujo durante la noche, y luego en el transcurso de la expresión experimento se mantiene por la presencia de varias cantidades de IPTG. El cloranfenicol se añadió cuando la densidad óptica a 575 nm fue 0,1. tiempos de duplicación fueron determinados mediante el control de crecimiento bacteriano (densidad óptica a 575 nm) en presencia y ausencia de cloranfenicol (34 g / ml). Símbolos: círculos abiertos, CM732 / pJKP1 / pJMH1 cultiva sin cloranfenicol cerrado círculos, CM732 / pJKP1 / pJMH1 crecer en presencia de rectángulos abiertos cloranfenicol, CM2555 / pJKP1 / pJMH1 cultiva sin cloranfenicol cerrado rectángulos, CM2555 / pJKP1 / pJMH1 cultiva en presencia de cloranfenicol. La actividad de la proteína CAT en CM2555 cepa. Se midió la acetilación del cloranfenicol y se calculó que la actividad total de CAT por 1 mg de proteínas celulares en CM2555 cepa / pBR328 fue mayor que en las muestras de análogos preparados a partir de la cepa parental, CM732 / pBR328 (unidades de actividad 1.20 gato en CM2555 / pBR328 frente 0,73 unidades de actividad CAT en CM732 / pBR328). Por otra parte, CAT revela actividad biológica, tanto en CM2555 / pBR328 y CM732 / pBR328, como la adición de cloranfenicol (hasta 34 g / ml) a los cultivos de estas cepas no tuvo efecto significativo sobre la eficiencia de la síntesis de proteínas (datos no presentados). La sensibilidad a cloranfenicol de la cepa CM2555 expresar los resultados del gato de disminución de los niveles de acetil-CoA. Desde CAT cataliza la transferencia del grupo acetilo de la acetil-CoA a una molécula de cloranfenicol, que mide los niveles de acetil-CoA en CM2555 cepa y cepa CM732 teniendo pBR328 plásmido en ausencia y en presencia de cloranfenicol. Se encontró que el nivel residual de acetil-CoA, sin la adición del antibiótico, fue ligeramente inferior en CM2555 / pBR328 respecto a la de CM732 / pBR328 (el nivel de la acetil-CoA en CM2555 / pBR328 era alrededor de 90 de la que se encuentra en CM732 / pBR328). Sin embargo, después de la adición de cloranfenicol, el nivel de la acetil-CoA era más o menos constante en CM732 / pBR328, mientras que disminuyó gradualmente en CM2555 / pBR328 (Fig.2 A y B). cantidad intracelular de acetil-CoA como afectada por cloranfenicol en E. coli CM732 / pBR328 (A) y CM2555 / pBR328 (B) y el efecto de acetato de sodio en el crecimiento bacteriano en presencia de cloranfenicol (C). En los experimentos cuyos resultados se representan en los paneles A y B, las cepas que albergan pBR328 se cultivaron en medio líquido Luria-Bertani. Se añadió cloranfenicol (34 g / ml) cuando la densidad óptica a 575 nm fue 0,1 (tiempo cero). Se retiraron muestras cada 5 min después de la adición del antibiótico y luego se analizaron para la acetil-CoA. Para cada cepa, se tomó la cantidad de acetil-CoA en el tiempo cero a ser 1, y se calculó la concentración relativa. En los experimentos cuyos resultados se representan en el panel C, E. coli CM732 y CM2555 pBR328 que albergan se cultivaron en medio líquido Luria-Bertani suplementado con diferentes cantidades de acetato de sodio. El cloranfenicol se añadió cuando la densidad óptica a 575 nm fue 0,1. Los tiempos de duplicación de las culturas se determinaron mediante el control de crecimiento bacteriano (densidad óptica a 575 nm) en presencia y ausencia de cloranfenicol (34 g / ml). Los valores presentados son medias de tres experimentos. En todos los casos la desviación estándar fue inferior a 10. Símbolos: círculos abiertos, CM732 / pBR328 crecido sin cloranfenicol cerrado círculos, CM732 / pBR328 crecer en presencia de rectángulos abiertos cloranfenicol, CM2555 / pBR328 cultiva sin cloranfenicol cerrado rectángulos, CM2555 / pBR328 cultiva en la presencia de cloranfenicol. Para probar si una disminución en el nivel de la acetil-CoA en CM2555 cepa / pBR328 es responsable de la sensibilidad de esta cepa al cloranfenicol, que mide las tasas de crecimiento de cultivos bacterianos en presencia de acetato de sodio. El acetato de sodio puede ser usado como una fuente alternativa de producción de acetil-CoA en las células (6). Se informó anteriormente (12) que el gato que expresan mutantes de E. coli con mutaciones en Acee o ACEF. que no puede hacer que la acetil-CoA a partir de piruvato, pero que puede hacer que la acetil-CoA a partir de acetato de sodio, son resistentes al cloranfenicol sólo cuando se suministra acetato de sodio. Por lo tanto, si la hipótesis se ha dicho fuera cierto, deberíamos haber observado mejoría en el crecimiento de CM2555 / pBR328 en presencia de acetato de sodio. De hecho, encontramos que la presencia de acetato de sodio mejoró dramáticamente el crecimiento de CM2555 / pBR328 en el medio que contiene cloranfenicol (Fig. 2 C). También se encontró que la cepa CM2555 podría ser transformado por los diferentes plásmidos que llevan el gen cat cuando la selección se realizó sobre placas que contienen tanto cloranfenicol (34 g / ml) y acetato de sodio 0,15 (datos no mostrados). Ni los pBR328 número de copias ni la cantidad de CAT en las células CM2555 se vio afectada por la presencia de acetato de sodio en el medio (datos no mostrados). Estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que la disminución de los niveles de acetil-CoA en las células que expresan gato CM2555 en presencia de cloranfenicol resultado de la sensibilidad de la bacteria a este antibiótico. AGRADECIMIENTOS Estamos muy agradecidos a S. y A. Baraska Szalewska-Palasz para la asistencia en la fase de experimentos preliminares y J. Davies para el debate y el apoyo al inicio de este proyecto. Este trabajo fue apoyado por el Comité de Estado polaco de Investigaciones Científicas (proyecto 6 P04A 060 18). G. W. También reconoce el apoyo financiero de la Fundación para la Ciencia Polaca (subsidio 14/2000). NOTAS Recibido el 18 de abril de 2001. devueltos para conversión 16 de julio de 2001. Aceptado 30 de agosto de 2001. Autor para la correspondencia. Dirección postal: Departamento de Biología Molecular, Universidad de Gdask, Kadki 24, 80-822 Gdańsk, Polonia. Teléfono: 48 (58) 346 3014. Fax: 48 (58) 301 0072. E-mail: Wegrzyn biotech. univ. gda. pl. Referencias Bolívar F. K. Backman (1979) Los plásmidos de Escherichia coli como vectores de clonación. Methods Enzymol. 68. 245 257.Chang C. Y. Cohen S. N. (1978) Construcción y caracterización de los vehículos de clonación de ADN de múltiples copias amplificables derivados de la p15A miniplasmid críptico. J. Bacteriol. 134. 1141 1156.Davies J. (1994) inactivación de los antibióticos y la diseminación de genes de resistencia. Ciencia 264. 375 382.Hansen F. G. von Meyenburg K. (1979) Caracterización de la dnaA. gyrB. y otros genes de la región dnaA del cromosoma de Escherichia coli en fagos transductores especializados lambda tna. Mol. Gen. Genet. 175. 135 144.Jensen K. F. (1993) Los tipos salvajes de Escherichia coli W3110 y MG1655 tiene cambio de marco mutación rph que conduce a la inanición pirimidina debido a los bajos niveles de expresión pira. J. Bacteriol. 175. 3401 3407.Jones-Mortimer M. C. Kornberg H. L. (1977) La interconversión enzimática de acetato y acetil-coenzima A en Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 102. 327 336.Kedzierska S. M. Staniszewska Potrykus J. Wegrzyn G. (1999) Los efectos de algunos plásmidos de resistencia a antibióticos que confieren a la eliminación de las proteínas agregadas al calor de Escherichia coli. FEMS Microbiol. Letón. 176. 279 284.Lewendon A. Shaw W. V. estabilización del estado (1993) Transición de cloranfenicol acetiltransferasa. J. Biol. Chem. 268. 20997 21001.Nikaido H. (1994) Prevención del acceso al medicamento a los objetivos de bacterias: las barreras de permeabilidad y expulsión activa. Ciencia 264. 382 388.Pr B. M. Wolfe J. A. (1994) La regulación de la síntesis de acetil fosfato y la degradación, y el control de la expresión flagelar en Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12. 973 984.Shaw W. V. (1975) de la cloranfenicol acetiltransferasa a partir de bacterias resistentes al cloranfenicol. Methods Enzymol. 43. 737 755.Shaw W. V. (1983) cloranfenicol acetiltransferasa: enzimología y biología molecular. Crit. Rev. Biochem. 14. 1 46.Shaw W. V. Packman L. C. Burleigh B. D. Dell A. Morris H. R. Hartley B. S. (1979) estructura primaria de una cloranfenicol acetiltransferasa especificado por plásmidos R. Los experimentos de la naturaleza 282. 870 872.Silhavy T. J. Berman M. L. Enquist L. W. (1984) con fusiones de genes. (Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, Nueva York).Singer M. Baker, TA Schnitzler G. Deischel SM Goel M. Dove W. Jaacks KJ Grossman AD Erickson JW bruto CA (1989) Una colección de cepas que contienen antibióticos alterna ligado genéticamente elementos de resistencia para el mapeo genético de Escherichia coli. Microbiol. 53. Rev. 1 24.Vester B. Garret R. A. (1988) La importancia de nucleótidos altamente conservadas en la región de unión de cloranfenicol en el centro de transferencia peptidil de Escherichia coli 23S ARN ribosomal. EMBO J. 7. 3577 3587.Vieira J. Messing J. (1988) Los plásmidos pUC, un sistema derivado de M13mp7 para la mutagénesis de inserción y la secuenciación con cebadores universales sintéticos. Gen 19. 259 268.Wegrzyn G. Kwasnik E. Taylor K. (1991) La replicación del plásmido en amino cepas de Escherichia coli ácido-hambre. Acta Biochim. Pol. 38. 181 186.Wegrzyn G. cristal R. E. Thomas M. S. (1992) La participación de la Escherichia coli subunidad ARN polimerasa en la activación transcripcional por el bacteriófago CI y CII proteínas. 122. gen 1 7.Wegrzyn A. Wegrzyn G. Taylor K. (1995) Protección de los colifagos O proteína iniciadora de la proteolisis en el ensamblaje del complejo de replicación in vivo. Virología 207. 179 184.Wegrzyn G. Wegrzyn A. Pankiewicz A. Taylor K. (1996) alelo especificidad de la función de los genes de Escherichia coli dnaA en la replicación de los plásmidos derivados de fago. Mol. Gen. Genet. 252. 580 586.Zaidenzaig Y. Fitton J. E. Packman L. C. Shaw W. V. (1979) Caracterización y comparación de las variantes cloranfenicol acetiltransferasa. EUR. J. Biochem. 100. 609 618.Zgurskaya H. I. Nikaido H. (2000) los mecanismos de resistencia a múltiples fármacos: salida del fármaco a través de dos membranas. Mol. Microbiol. 37. 219 225.Copyright 2001 Sociedad Americana de Microbiología