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La fosforilación de la tirosina del receptor GABA A subunidad 2 Regula tónica y fásica La inhibición de las Contribuciones de los autores del tálamo: D. P.B. y T. G.S. F. N. de investigación diseñado V. T. investigación realizada y S. J.M. contribuido reactivos no publicados / herramientas analíticas F. N. D. P.B. y R. R.-S. F. N. datos analizados y T. G.S. escribió el documento. la inhibición tónica y fásica mediada por GABA Resumen de las neuronas talámicas de relevo del núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se estudió después de la ablación de la tirosina (Y) de la fosforilación del receptor de 2 subunidades. A medida que la fosforilación de Y365 y Y367 2 reduce la internalización del receptor, para comprender su importancia para la inhibición creamos un knock-in ratón en el que estos residuos se sustituyen por fenilalaninas. En la comparación de tipo salvaje (WT) y 2 Y365 / 367F / (HT) animales (homocigotos no son viables en el útero), los niveles de expresión de receptor GABA A 4 subunidades se incrementaron en el tálamo de la hembra, pero no ratones machos. Elevación de los niveles de expresión de la subunidad también se observaron en mujeres 2 Y365 / 367F / tálamo. análisis electrofisiológicos revelaron ninguna diferencia en el nivel de inhibición en el macho WT y HT dLGN, mientras que tanto la actividad espontánea postsináptico inhibitorio y la corriente tónico se aumentaron significativamente en las células de relé HT femeninos. La sensibilidad de las corrientes tónico para el THIP superagonista subunidad, y el bloqueador de Zn 2. fueron mayores en células de transmisión HT femeninos. Esto es coherente con la regulación positiva de los receptores GABA A que contienen extrasinápticos de 4 y subunidades para mejorar la inhibición tónica. Por el contrario, la sensibilidad de los receptores GABA A que media la inhibición en la hembra 2 Y356 / 367F / a neuroesteroides se redujo notablemente en comparación con WT. Llegamos a la conclusión de que la interrupción de la fosforilación de tirosina de la subunidad 2-activa un aumento específico del sexo en la inhibición tónica, y esto refleja probablemente un mecanismo de compensación basada en la genómica para la reducción de la sensibilidad de neuroesteroides de inhibición medido en neuronas de relevo HT femeninos. la inhibición mediada por GABA introducción requiere la activación de los receptores de GABA (GABA A Rs) (Sieghart y Sperk, 2002). En la hendidura sináptica, las concentraciones milimolares de GABA permiten la inhibición fásica rápida, pero breve de la excitabilidad neuronal postsináptico (Mody et al. 1994). Mientras sinapsis fuera, las concentraciones de GABA nanomolares activar tónicamente Rs extrasinápticos GABA A, proporcionando una forma persistente, menos espacialmente restringida de señalización (Otis et al. 1991 Mody, 2001). Tanto fásica y la inhibición tónica se modifican por cambios en la liberación de GABA y la absorción, y por alteraciones en los números de GABA A R y sus propiedades funcionales innatas (Overstreet et al., 2000 Bianchi y Macdonald, 2002 Petrini et al., 2004 Luscher et al. 2011). Un mecanismo importante que modula la eficacia de la inhibición implica la fosforilación de Rs GABA A, que afecta a su función y el tráfico (Moss y Smart, 1996 Brandon et al., 2003 Kittler et al., 2008 Abramian et al., 2010). En particular, la endocitosis dependiente de clatrina de GABA A Rs requiere la interacción de - y 2 subunidades con la proteína clatrina adaptador, AP2. La fosforilación de (S409 en 13, S410 en 2) y 2-subunidades (Y365 / 367) por serina-treonina quinasas y tirosina quinasas, respectivamente, regula el GABA A interacción R-AP2 estabilizando de este modo los receptores en las sinapsis inhibidoras (McDonald et al. 1998 Brandon et al., 2003 Kittler et al., 2008). La fosforilación de la subunidad 4 (S443) también puede promover la estabilidad de la superficie celular de GABA A Rs responsables de la inhibición tónica (Abramian et al., 2010). Para entender mejor el papel de la fosforilación de GABA AR en la conformación de la eficacia de la inhibición sináptica, se utilizó un 2 knock-in ratón en el que los principales sitios de fosforilación de la tirosina dentro del GABA AR 2-subunidad se mutaron a fenilalaninas (Y365 / 367F) . Anteriormente hemos observado que los homocigotos Y365 / 367F es letal y que los heterocigotos machos exhiben una mayor acumulación de Rs sinápticos de GABA A en la región CA3 del hipocampo debido al tráfico aberrante dentro de la vía endocítica. Esta inhibición mejorada correlacionado con un déficit específico en el reconocimiento de objeto espacial, un rasgo de comportamiento que está asociado con CA3 regio (Tretter et al. 2009). Aquí, hemos utilizado este modelo animal para evaluar si las mutaciones tirosina afectaban a la expresión de subunidades de 4 y, ambos componentes críticos de Rs extrasinápticos GABA A que median la inhibición tónica en varias áreas del cerebro anterior (Cope et al., 2005 Chandra et al. 2006). De hecho, poco se sabe acerca de cómo las neuronas lograr la unidad de los modos distintos de inhibidores fásica y tónica. Estudiamos el núcleo dorsal lateral geniculado (dLGN), una parte del centro de relé talámico importante para el procesamiento de la información visual. En el dLGN, 12 GABA A Rs son principalmente responsables de la inhibición fásica (Soltesz et al. 1990 Okada et al. 2000), mientras que la inhibición tónica depende de 4 receptores (Cope et al. 2005 Bright et al. 2007). Utilizando una grabación de patch-clamp, inmunocitoquímica, y la inmunotransferencia, se encontró que Y365 / 367F mejorado tanto fásica y la inhibición tónica en sólo hembras. Para la inhibición tónica, la prevención de la fosforilación de tirosina de 2 subunidades dio lugar a una regulación por incremento específico del sexo en el número de Rs GABA A que contienen extrasinápticos 4- y subunidades, lo que indica que la plasticidad a largo plazo de fásica y niveles tónicas de la inhibición mediada por GABA pueden ser relacionados entre sí. Materiales y Métodos Animales. Se llevaron a cabo todos los procedimientos de acuerdo con los Animales (Procedimientos Científicos del Reino Unido) Acta de 1986. Los animales fueron alojados en condiciones controladas a 1923C, en un ciclo de 12 h de luz alterna / oscuridad, en una habitación ventilada con acceso a comida y agua ad libitum. Los ratones homocigotos para la mutación Y365 / 367F no sobreviven en el útero. pero heterocigotos continúan en la edad adulta (Tretter et al., 2009). GABA A R 2 Y365 / 367F heterocigotos knock-in (Y365 / 367F /) ratones y controles de la misma camada se mantuvieron en un 6J fondo C57BL / genética y había sido backcrossed al menos nueve veces. progenie resultante fueron seleccionadas por PCR usando muescas en las orejas tomadas a las 2 semanas después del parto para determinar el genotipo. Los cebadores fueron los siguientes: cebador directo: 5-CAG GGT AAT TGC TAG GCC TGT TGG C-3 cebador inverso: 5-CCA CAA TGT CAT CAA TGA GAT GAT G-3. Los ratones fueron separados al destete en grupos littermate masculinos y femeninos. Inmunohistoquímica. Juvenil (P21P28) macho y hembra 2 knock-en ratones (Y365 / 367f Tretter et al., 2009) fueron anestesiados y perfundidos por vía intracardiaca con solución salina seguido de paraformaldehído al 4. Se extrajeron los cerebros rápidamente, después se fijaron durante la noche, y en el 30 cryoprotected sacarosa. Secciones (40 m 8 por cerebro) se cortaron usando un micrótomo de congelación y después se incubaron durante 10 min en 0,1 H 2 O 2 para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Después de lavar en PBS, las secciones se incubaron durante 2 h en solución de bloqueo (2 suero normal de caballo, 0,5 albúmina de suero bovino w / v, y 0,3 Triton X-100 en PBS) seguido por incubación durante 48 h a 4ºC en solución de bloqueo que contiene el anticuerpo policlonal primario contra el 4 de la subunidad (1: 1000 regalo de W. Sieghart (Viena) Bencsits et al., 1999). Después de lavado en PBS, las secciones se incubaron en solución de bloqueo que contiene el anticuerpo anti-conejo biotinilado durante 2 h a temperatura ambiente, luego se enjuagaron en PBS y se incubaron durante 1 h en una solución de ABC (kit Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories). Después del lavado, las secciones se incubaron durante 10 min en diaminobencidina (sustrato de peroxidasa) que contienen cloruro de níquel como reactivo de mejora. La reacción se terminó lavando dos veces en agua. Las secciones fueron montadas en portaobjetos, se secaron al aire, se deshidrataron a través de alcoholes graduados seguido de xilenos, y después se monta para su visualización. Las secciones se visualizaron con un microscopio Olympus BX51 (Olympus Optical). mediciones de densidad óptica se obtuvieron a partir de secciones en serie de tipo salvaje (WT) y el cerebro HT. Las densidades ópticas HT se normalizan a los valores medios obtenidos a partir de cerebros WT. Estas medidas se repitieron en experimentos separados para los ratones machos y hembras. El análisis de transferencia Western. dLGN se diseccionó rápidamente hacia fuera de cortes coronales (250 m de espesor) obtenida a partir de juvenil masculino (P21P28) y hembra 2 knock-en ratones y se homogeneizaron en un tampón que contiene 150 mm NaCl, 50 mM de Tris, pH 8,0, 5 mM de EDTA, 1 nonil phenoxypolyethoxylethanol, 0,5 desoxicolato de sodio, 0,1 SDS, 1 phenylmethanesulfonylfluoride en presencia de inhibidores de proteasa (Thermo Scientific). La muestra se hizo girar durante 1 h a 4ºC y después se centrifugó a 16.100 g durante 15 min a 4ºC el sobrenadante se recogió como la fracción de proteína total. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). Cualquiera de 20 g (subunidad) o 30 g (4-subunidad) de la fracción de proteína total se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida 10, se sometió a electroforesis y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa pura. La membrana se bloqueó en leche descremada 4 y se sondeó con anticuerpos policlonales específicos para (1: 1000) o 4 (1: 4000 ambos regalos de W. Sieghart, Viena) o anticuerpo monoclonal específico para la tubulina (1: 1000). Las transferencias se incubaron con marcado con peroxidasa anti-conejo o anti-ratón-IgG (1: 10.000) y las proteínas inmunorreactivas se visualizaron usando quimioluminiscencia potenciada. La densidad óptica se determinó utilizando el software ImageJ. Tubulina se utilizó como control de carga. rodaja de preparación. rebanadas talámicas coronales (250 m de espesor) se cortaron en una solución de corte compuesta de los siguientes (en mm): 130 K-gluconato, 15 KCl, 0,05 EGTA, 20 HEPES, 4 Na-piruvato, 25 de glucosa, y 2 de ácido quinurénico, pH a 7,4 con NaOH, burbujear con 95 O 2 y 5 de CO 2 usando una máquina de cortar Leica VT1200S Vibratome. Las rebanadas se incubaron a 37ºC durante 1 h, durante la cual la solución de gluconato de corte en rodajas se reemplazó gradualmente con CSF artificial (ACSF) que contiene los siguientes (en m m): 125 NaCl, 26 de NaHCO3. 2,5 KCl, 1 MgCl 2. 1.25 NaH 2 PO 4. 2 CaCl 2. 25 glucosa, y 2 de ácido quinurénico. Los cortes se mantuvieron después a temperatura ambiente en esta solución, burbujeado con 95 O 2/5 CO 2. hasta que se requiera. Electrofisiología. neuronas talámicas en la dLGN se identificaron visualmente usando un microscopio Nikon Eclipse FN1 equipado con un objetivo de inmersión 40 y una cámara de video. De células enteras grabaciones de fijación de voltaje se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices). Parche pipetas (de vidrio de borosilicato de pared fina, GC150TF-10 Harvard Apparatus) tenían resistencias de 35 M cuando se llena con solución intracelular contenía lo siguiente (en m m): 140 CsCl, 2 NaCl, 10 HEPES, 5 EGTA, 2 MgCl 2. 0,5 CaCl 2. 2 Na-ATP, 2 QX-314, y 5 de sacarosa pH 7,3 con 1 m CsOH. Bicuculina, 3,5-tetrahydrodeoxycorticosterone (THDOC), 4,5,6,7-tetrahidroisotiazolo-5,4-cpiridin-3-ol (THIP), y cloruro de zinc se añadieron a la LCRa. ortovanadato de sodio (Na 3 VO 4. 100 m) se incluyó en la solución de electrodo en algunos experimentos. Adquisición de datos y análisis. Las corrientes de membrana se pasa bajos filtrada a 5 kHz y adquirió a 20 kHz. resistencia en serie se compensó con 40 y los datos desechado si esta aumentado en 25. Las corrientes y las diferencias se analizaron fuera de línea utilizando WinEDR y WinWCP (John Dempster, Universidad de Strathclyde, Reino Unido). Para determinar las corrientes promedio de retención, se midió una grabación de corriente continua para un 60 s época muestreado cada 1 s, descartando aquellas coincidente con IPSCs espontáneas (sIPSCs). Un efecto del fármaco en la corriente de retención se define por la diferencia entre las corrientes de retención medio en el control y durante la aplicación del fármaco. Todos los puntos histogramas fueron construidos para las muestras de datos toma de corriente de mantenimiento antes y después de bicuculina (20 s) y equipado con una única función de distribución gaussiana de la siguiente forma: El ajuste se vio limitada simétricamente alrededor del pico de frecuencia para evitar cualquier sesgo causado por el presencia de sIPSCs. A define la amplitud y C es una constante que define el pedestal del histograma. Esta función proporciona la corriente media de Gauss línea de base () y SD (). El ruido de la línea de base (media cuadrática, rms) también se calculó antes y durante el tratamiento bicuculina. Para la estimación de ruido promedio de referencia, una grabación de corriente continua se analizó en un 30 s época y se tomaron muestras cada 100 ms en el caso de grabaciones de control (durante el cual sIPSCs están presentes), la mediana se calculó cada 5 s y valora 2 desviaciones estándar por fuera de la mediana (mayor variación refleja sIPSCs) se descartaron. ruido de la corriente mediada por GABA de la línea de base se define como la diferencia entre los valores eficaces antes y después de bicuculina. sIPSCs se detectaron utilizando criterios en amplitud y basados en la cinética con el Programa MiniAnalysis 6.0.7 (Synaptosoft). Frecuencia se calculó utilizando los eventos detectados más de 60 s épocas. Al menos 100 sIPSCs no contaminadas se utilizaron para construir las formas de onda sIPSC promediados y para estimar los parámetros cinéticos. La expresión de los receptores y la electrofisiología recombinantes GABA A. Se transfectaron células HEK293 usando un protocolo de fosfato de calcio. Se utilizaron cantidades iguales de ADNc que codifican subunidades GABA A R y aumento de proteína verde fluorescente (4 g en total por plato). Las células se utilizaron para electrofisiología 1624 h después de la transfección. Las células se perfundieron de forma continua a temperatura ambiente con solución de Krebs que contiene la siguiente (en m m): 140 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl 2. 2,52 CaCl2. 11 glucosa, y 5 HEPES, ajustado a pH 7,4 con 1 m NaOH. pipetas de parche (34 M) se llenaron con una solución intracelular contenía lo siguiente (en m m): 1 MgCl 2. 120 KCl, 11 EGTA, 10 HEPES, 1 CaCl 2. y 2 trifosfato de adenosina, se ajustó a pH 7,2 con 1 m NaOH. Na 3 VO 4 (100 m) y Src quinasa activa (1,44 10 3 U / ml Merck Millipore) fueron incluidos en la solución de electrodo en algunos experimentos. GABA corrientes activadas de células enteras se registraron a partir de células HEK sujetadas a las 10 mV, se filtra a 5 kHz, y se digitalizan a 50 kHz. GABA y soluciones que contienen THDOC-se aplicaron localmente a través de un sistema de aplicación de tubo en U (Mortensen y Smart, 2007), la duración de la aplicación de GABA fue de 2 s. Amplitudes de las respuestas de GABA de células enteras se midieron y se normalizó a la respuesta máxima provocada por la saturación de concentraciones de GABA. Cada curva de dosis-respuesta a GABA fue curva ajustada utilizando la siguiente ecuación de Hill: Y es la respuesta del pico de GABA, Y max representa la respuesta máxima de pico a concentraciones saturantes de GABA, EC 50 es la concentración de GABA, A, produciendo 50 de la máxima respuesta, y n es el coeficiente de Hill. Análisis estadístico. Los datos se expresan como media ± SEM. Las pruebas se realizaron con Origen 6.0 (OriginLab). Una prueba ShapiroWilk determina si los datos se distribuyen normalmente y, si es así, las diferencias entre los dos grupos fueron examinadas usando estudiantes apareados y no apareados prueba de la t. En relación con el análisis de asociación, la significación estadística se evaluó con el coeficiente de correlación de Pearson. Las diferencias entre más de dos grupos se evaluaron mediante ANOVA ordinario y de medidas repetidas y los métodos no paramétricos con pruebas post hoc, según el caso. efecto Resultados Sexo-específico de 2 Y365 / 367F en los niveles de expresión de 4 subunidades para investigar cómo la fosforilación de las subunidades GABA AR puede permitir que las neuronas para regular la inhibición mediada por el GABA, hemos utilizado nuestro ratón knock-in para el cual los residuos Y365 y Y367 en el GABA AR 2 de la subunidad se han mutado a fenilalaninas (Y365 / 367F). En principio, esta sustitución debe impedir la internalización del receptor y por lo tanto potenciar la inhibición fásica (Kittler et al. 2008 Tretter et al. 2009), pero las consecuencias para la inhibición tónica son desconocidos. En primer lugar, se utilizó la inmunohistoquímica para evaluar el impacto de los residuos de conmutación en los niveles de expresión de las subunidades GABA A R que median la inhibición tónica. El 4-subunidad fue seleccionado debido a su implicación en los receptores de extrasinápticos y la inhibición tónica en el giro dentado (DG), así como los núcleos talámicos específicos (Cope et al. 2005 Chandra et al. 2006 Bright et al. 2007 Shen et al. 2007 ). Se compararon 4-subunidad niveles de expresión en el cerebro de Y365 / 367F heterocigotos de la misma edad (HT) y los compañeros de camada WT (homocigotos no son viables en el útero Tretter et al. 2009). Mientras que en los machos HT 4 expresión de la subunidad se redujo en la Dirección General (55,4 6.4, n = 5, p 0,01), lo que podría afectar el nivel de inhibición tónica (Fig. 1 B, C). Los niveles de expresión de la subunidad 4-se incrementan de una manera específica de un sexo en HT (/ 2 Y365 / 367F) ratones. A . B. Todo el cerebro secciones sagitales (40 m) de macho (A) y hembra (B) los ratones WT y HT Inmunomarcamos por 4 subunidades de rábano picante, seguido de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Las flechas indican la DG (superior) y el tálamo (inferior). C. Los gráficos de barras de la densidad óptica media 4 medido en macho y hembra HT, tanto tálamo y la DG, en comparación con el WT (n 100 5 para el varón y la DG tálamo n 6 a femenino DG y tálamo) p 0,01. 4 y subunidades expresión en hembra 2 Y365 / 367F / A partir de 4 receptores son considerados para mediar en la inhibición tónica en el dLGN (Cope et al., 2005 Bright et al., 2007), se utilizó el análisis de Western blot para investigar de 4 y subunidades los niveles de expresión relativos en 2 knock-en los animales (Fig. 2 a, B). En los animales hembra y macho WT y HT, las fracciones de proteína total dlgn se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-4, con niveles de tubulina utilizados como control de carga (Fig. 2 A). La comparación de las bandas 4-subunidad inmunorreactivas revelaron un aumento significativo en HTs femeninos en comparación con WT (test KruskalWallis con Dunns-de comparación múltiple post-test, p 0,05, n 3, pares de WT y HT varones de la misma edad). La expresión de GABA A R 4 y subunidades en 2 ronda en dLGN. A . B. Izquierda, análisis por inmunotransferencia de 4 (A) y la proteína (B) (30 g / carril o 20 g / carril, respectivamente) en el total de los homogeneizados preparados a partir de la dLGN de macho (n 3) y hembra (n 10 4) y sólo hembra (n = 7) los ratones de la misma edad. Tubulina se utiliza como un estándar interno. se muestran los marcadores de peso molecular. A . B. Derecho, gráficos de barras de informes media 4 (A) y expresión (B) en el TC dLGN comparación con WT femenina. La densidad óptica de las bandas se corrige de acuerdo con el estándar de la tubulina y normalizado a los niveles hembra WT (100, p 0,05). Teniendo en cuenta que 4 subunidades son frecuentemente coassembled con subunidades en Rs extrasinápticos GABA A (Sur et al., 1999 Jia et al., 2005), también se evaluaron los niveles de expresión de la subunidad en animales WT y HT hembra (Fig. 2 B). Las transferencias Western indicó incremento significativamente la expresión de subunidades en ratones tolerantes a los herbicidas en comparación con el WT (143 16, n 7, la edad de los partidos WT y HT pares, p. Figura 2 B). De este modo, tanto la inmunotransferencia e inmunohistoquímica proporcionan evidencia de un efecto específico del sexo de la mutación 2 Y365 / 367F en los niveles de expresión de la subunidad 4 en el tálamo, junto con los niveles subunidad extrasinápticos aumentada en la dLGN de la hembra 2 Y365 / 367F /, potencialmente afectar el nivel de inhibición tónica. la inhibición tónica y fásica en dLGN masculina para 2 Y365 / 367F / se ve afectada Dada la clara diferencia en los niveles de expresión y 4, que examinó por primera tónica actual mediada por GABA en las neuronas del tálamo relé del macho dLGN. Estas células muestran una conductancia mediada por GABA R Un tónico que se basa en extrasynaptic de 4 y subunidades (Cope et al. 2005), y en la liberación de GABA vesicular (Bright et al. 2007), mientras que la inhibición fásica implica que contiene 2-subunidad GABA A Rs. El uso de células enteras de grabación en rebanadas del tálamo graves en las condiciones de control (en presencia de 2 M de ácido quinurénico m), bicuculina (20 m) bloquearon la sIPSCs y claramente reducido tanto la celebración de ruido de línea de base actual y eficaz. Esto reveló una corriente tónicamente activa GABA (en ausencia de aplicada GABA), de acuerdo con los informes anteriores (Cope et al. 2005 Bright et al. 2007 Fig. 3 A). La comparación de las neuronas WT y HT relé masculinos, no hubo diferencias en la corriente de retención (WT tónica actual 49,7 11,4 pA, n 11 HT 54,1 8,6 pA, n 8 p 0,778 Fig. 3 A, B) y rms de ruido de línea de base (WT 1,5 0,2 pA HT 1,5 0,4 pA p 0,961 Fig. 3 A, C). La comparación de las propiedades de sIPSCs en las mismas neuronas de relevo de WT y HTs en ratones macho reveló frecuencias similares (Fig. 3 D), significa amplitudes sIPSC (Fig. 3 E), y el aumento (Fig. 3 F) y los tiempos de desintegración (Fig . 3 G). Por lo tanto, para las neuronas de relé dLGN machos de ratones Y365 / 367F, no hubo efectos evidentes de la prevención de la fosforilación de tirosina de la subunidad 2-a cada tónica o fásica de inhibición. 2 Y365 / 367F no afecta a la inhibición en el varón dLGN. A . corrientes representativas registradas en una explotación potencial de 60 mV a partir de neuronas de relevo dlgn en el documento WT (izquierda) y HT (derecha). (20 m barra gris) bloquea internas sIPSCs y revela un desplazamiento hacia fuera de la corriente de mantenimiento y una reducción en el ruido rms de línea de base de baño-aplicado bicuculina. Las corrientes que llevan a cabo antes y después de bicuculina se muestran como líneas punteadas. Las curvas gaussianas representan la corriente media y su SD dejar de lado la distorsión causada por las sIPSCs (ver Materiales y Métodos). B. Los gráficos de barras de la celebración de las corrientes medias en ACSF, después de bicuculina (BIC) y la corriente resultante tónico para GABA WT (n = 11) y las neuronas de relevo HT dlgn (n 8 p 0,778). C. Los gráficos de barras de ruido rms media en ACSF, después de bicuculina y el ruido resultante GABA actual en WT (n = 11) y las neuronas de relevo HT dlgn (n 8 p 0,961). D. E. sIPSC frecuencia (D) y la amplitud (E) son similares en varones neuronas WT y HT dLGN relé (p 0,086 y p 0,930, respectivamente). F. G. sIPSC subida (F) y los tiempos de desintegración (G) son comparables entre el macho WT y las neuronas de relevo HT dlgn (p 0,073 y p 0,730, respectivamente). El aumento de la inhibición tónica en dLGN hembra de 2 Y365 / 367F / alteraciones periódicas en subunidades específicas GABA A R puede ocurrir durante el ciclo estral en ratones, causando cambios cíclicos de la inhibición tónica en las neuronas del hipocampo. En particular, durante el diestro tardía (fase de alta progesterona), el aumento de expresión de GABA A R subunidades llevado a un aumento de la inhibición tónica (Maguire et al. 2005). Para evitar variaciones del ciclo estral confundiendo a nuestros estudios, y para poder comparar con los resultados de machos juveniles, grabaciones se realizaron a partir de ratones hembra juvenil. Para neuronas WT dlgn de ratones hembra, la media mantenida (131,6 18,6 pA en ACSF) se redujo en un 20 m bicuculina (116,9 18,8 pA Fig. 4 A), mientras que el valor eficaz del ruido de línea de base fue de 4,0 0,3 y 3,4 0,2 pA, respectivamente ( n 20 de la Fig. 4 A). En comparación, para células de transmisión HT, una media actual de 117,7 14,2 pA en ACSF que sostiene se redujo en bicuculina a 92,3 12,6 Pa (Fig. 4 B) con rms de ruido de línea de base de 5,0 0,3 y 4,0 0,3 pA, respectivamente (n 26 Fig. 4 B). Tanto la tónica actual GABA (25.4 3.2 pA) y el ruido de la corriente (1,0 0,2 pA Fig. 4 B) se aumentaron significativamente en células de transmisión HT femeninos en comparación con el WT (14,7 1,8 0,1 y 0,6 pA, respectivamente, p 0,01). 2 Y365 / 367F aumenta la inhibición tónica en dLGN femenina. A . B. Arriba, corrientes registradas de WT (A) y HT (B) dLGN neurona relé a 60 mV. Aplicación de bicuculina (20 m. De barras) bloquea la conductancia tónico y reduce el ruido de fondo. Nota neuronas de relevo HT femenina muestran un aumento de GABA tónica actual y el ruido. Los gráficos muestran las corrientes de sujeción (medio) y valores de ruido rms de línea de base (parte inferior) para todas las células WT registrados en la hembra (izquierda n 20) y (26 n derecha) ratones tolerantes a los herbicidas. Los valores en ACSF se muestran en rojo y después de la aplicación bicuculina en azul, mientras que el resultado GABA mediada tónica actual se muestra en negro. valores medios respectivos están en el mismo color, desplaza a la derecha. Inserciones a gráficos representan una ampliación de los valores tónicas. Tanto HT significa tónica actual y GABA A mediada ruido de la corriente son aumentados significativamente. p 0,05 en comparación con WT. phasic inhibición en dLGN hembra 2 Y365 / 367F / se potencia la activación tónica de dLGN subunidad GABA A Rs es sensible al nivel general de la inhibición como si depende de desbordamiento de la liberación de GABA presináptica. De hecho, la conductancia tónico cuando se abolió la probabilidad de liberación del transmisor se reduce o liberación evocada potencial de acción fue bloqueada (Bright et al., 2007). Para explorar si la inhibición tónica femenina aumentó en 2 Y365 / 367F / podría depender de una mayor liberación presináptica de GABA, se analizaron las frecuencias sIPSC en las neuronas de relevo WT y HT dlgn femeninos. Esto se aumentó de 4,5 0,4 Hz (WT) a 7,1 0,7 Hz (HT) (n 2026 p. Fig 5 A, B). la inhibición sináptica en las neuronas de relevo de dlgn femenina WT y 2 Y365 / 367F / mice. A . Grabaciones de sIPSCs obtenidos a partir de neuronas de relevo WT y HT dlgn mantuvo a 60 mV en presencia de 2 m m ácido quinurénico a temperatura ambiente. El recuadro representa las formas de onda promedio (véase Materiales y Métodos) para estas células (WT, HT negro, gris). Nota aumento de la amplitud y la cinética sIPSC sin cambios de células HT. B. C. Análisis de sIPSC interevent intervalos (B) y amplitudes (C) para WT y HT dlgn neuronas de relevo tomadas de las rebanadas del tálamo de ratones hembra juveniles. Histogramas están equipados con la suma de tres distribuciones gaussianas (2000 eventos por genotipo) en ratones WT y HT. La flecha indica la media de los eventos de amplitud más grandes de HTs, una población encontró poca frecuencia en WT. D. E. La media de tiempo de subida (D) y el tiempo de extinción (E) para sIPSCs de neuronas de relevo WT y HT dlgn femeninos. La distribución de todos los intervalos interevent para sIPSCs en neuronas de relevo WT y HT fue descrito por la suma de tres componentes gaussianos. Los medios para las tres poblaciones de Gauss se redujeron indicando intervalos más cortos entre sIPSCs registrados a partir de neuronas de relevo HT dlgn (Fig. 5 B). La amplitud sIPSC significar también fue aumentado significativamente desde 29,5 1,5 pA (WT) al 36,1 2,5 pA (HT) (n 2026 p Fig. 5 A) y esto podría tener aparentemente aumentó la frecuencia sIPSC tras el aumento de la resolución de los pequeños, no detectada previamente, la amplitud eventos. El examen de las distribuciones de amplitud sIPSC reveló tres poblaciones distintas con una mayor proporción de sIPSCs de mayor amplitud para el HTS (Fig. 5 C). El análisis de la cinética sIPSC en los respectivos genotipos reveló que los tiempos de subida y caída fueron comparables entre WT y HT hembra neuronas dLGN de relé (p 0,835 y p 0,355, respectivamente. Fig 5 D, E). Por lo tanto, en las neuronas femeninos, la mutación 2 Y365 / 367F sólo aumentó la amplitud media sIPSC y frecuencia. La evaluación de los parámetros sIPSC en todas las condiciones (femenino y masculino, WT y HT), ya sea con ANOVA (aumento y de disminución) o pruebas KruskalWallis (frecuencia y amplitud), según el caso, reveló que la frecuencia media de sIPSC y la amplitud en el TC femenina se incrementaron en comparación con WT. Además, para el varón WT y HT, frecuencias sIPSC se aumentaron significativamente en comparación con WT hembra (p 0,01, respectivamente). Este aumento de la frecuencia puede dar cuenta de las corrientes más grandes tónico medidos en los hombres. La coincidencia de fásica y la inhibición tónica en las neuronas de relevo dLGN femeninos Para entender mejor la interacción entre fásica y la inhibición tónica en ratones WT y HT femeninos, que trazan las corrientes tónico individuales medidos en WT y HT dlgn neuronas de relevo en contra de las frecuencias y amplitudes medias sIPSC, medido en las mismas células. Para WT no había relación entre las corrientes tónico y frecuencias sIPSC relativos (r 0,032, p 0,888) (Fig. 6 A), mientras que para las neuronas de relevo HT, una relación lineal fue evidente (r 0.567,. P Fig 6 B). Relación entre la inhibición tónica y fásica en dLGN femenina. Parcelas de media GABA mediada por las corrientes tónico contra frecuencias medias sIPSC (arriba) o amplitudes (abajo) para todas las células examinadas de WT hembra (A) y los animales tolerantes a los herbicidas (B). correlaciones positivas entre la tónica actual y tanto la frecuencia media y la amplitud sIPSC solamente están presentes en las neuronas de relevo HT dlgn (p 0,05). El aumento de la corriente inducida en THIP femenina relé HT dLGN neuronas Los niveles más altos de inhibición tónica en las neuronas de relevo femenino HT dlgn se explica por el aumento de la expresión de GABA A R 4 y subunidades en comparación con WT. La presencia de la subunidad confiere propiedades farmacológicas únicas en Rs GABA A incluyendo una alta sensibilidad a la THIP superagonista (Brown et al. 2002 Cope et al. 2005 Mortensen et al. 2010). Para determinar la naturaleza de la subunidad de Rs GABA A que sustentan el actual tónico en las neuronas WT y HT hembra, 1 m THIP, una concentración que es selectivo para Rs GABA A que contienen la subunidad se aplicó (Brown et al. 2002 Jia et al. 2005 Mortensen et al., 2010). THIP activa rápidamente una corriente hacia el interior más de 3 min y el aumento de ruido de corriente tanto para WT y neuronas talámicas HT de una manera reversible (Fig. 7 A, B). Para neuronas WT femeninos, la THIP inducida corriente de entrada fue 163,3 28,4 pA (Fig. 7 A), que fue significativamente aumentada en las neuronas TH hembra (266,2 31,6 pA n 11, p Fig. 7 B). Tomado en conjunto, esto sugiere que un mayor número de Rs extrasinápticos que contiene subunidad-GABA A en las mujeres HT podría apuntalar el nivel más alto de inhibición tónica mostrada por estos animales. Thip corrientes en las neuronas de relevo WT y HT dlgn femeninos. Gráficos de corriente de WT (A. arriba) y HT (B. arriba) neuronas de relevo dlgn a 60 mV. Baño-aplicado THIP (bar) aumenta la corriente GABA tónica y ruido de línea de base asociada en el WT y en mayor medida en las neuronas de relevo HT dlgn. A . B. En pocas palabras, gráficos muestran persona en posesión de los valores actuales en ACSF (símbolos de la izquierda), después de la aplicación THIP (símbolos medias), y la consiguiente THIP inducida por la corriente de entrada (I, los símbolos de la derecha) para todas las células examinadas de WT (n 8) y HT animales (n 11). valores medios respectivos se desplazan a la derecha. Nota media inducida por THIP corriente de entrada es significativamente mayor en comparación con WT HT (p 0,05). Para neuronas WT dlgn masculinos, la THIP inducida por la corriente de entrada (168,4 11,5 pA n 6) no fue diferente a la medida en dlgn neuronas de relevo de hembras WT (p 0,885). Esto indica que hay extrasinápticos 4 niveles similares GABA A R en el tálamo de WT femenina y animales machos y, posiblemente, la tónica actual más alta en los hombres es probable que sea debido a la liberación de GABA presináptica aumentar los niveles de GABA ambiente. El aumento de Zn 2 - Block de la inhibición tónica en hembra 2 Y365 / 367F / concentraciones micromolar de Zn 2 tienen poco efecto en 12/32 Rs GABA A, que son los principales responsables de la inhibición fásica en el tálamo (Draguhn et al., 1990 Inteligente y Constanti , 1990 Soltesz et al. 1990 inteligente et al. 1991. 1994 Okada et al. 2000 Pirker et al. 2000 Sasso-Pognetto et al. 2000), pero sustancialmente inhibir la corriente mediada por Rs GABA a que contienen la subunidad (Saxena y Macdonald , 1994 Krishek et al. 1998). Para corroborar nuestra observación de que Rs GABA A que contienen la subunidad extrasinápticos están regulados por incremento en el tálamo de los HT hembra, se trataron las neuronas WT y HT dlgn con 30 m 2. Zn una concentración selectiva por los receptores que contienen la subunidad-(Smart et al. 1994 Jia et al. 2005 Fig. 8 A, B). posteriormente Se aplicaron 20 m bicuculina para comparar el bloque inducida por Zn 2 con la causada por la bicuculina (Fig. 8 A, B). Análisis de las células de relé WT dlgn hembra revelaron que la media hacia el exterior actual (bloque tónico) inducida por Zn 2 fue 10,9 1,8 pA, mientras que el bloque bicuculina residual era 7,9 1,9 pA (n 6 Fig. 8 A, C). B. C. B. C. B.
